Sagarose®超低电内渗琼脂糖
Agarose with ultra-low EEO
一、产品描述
Sagarose®琼脂糖系列产品搭载革新性第二代脱硫技术，突破天然海藻原料波动桎梏，通过分子级精控工艺实现凝胶强度、电内渗等核心指标的自由调控。
Sagarose®超低电内渗琼脂糖拥有极低的电内渗（EEO=0.03），使得DNA的电泳迁移率显著高于传统琼脂糖凝胶，减少条带扩散的影响，提高电泳分辨率，非常适合常规核酸，同时也适合对流免疫电泳和交叉免疫电泳。
二、基础参数
外观
白色/微黄色粉末
凝胶强度(1.5%，g/cm2)
≥2000
凝胶温度(1.5%，℃)
40.0±2
熔胶温度(1.5%，℃)
91.0±2
黏度(4.0%，mPa·s)
≤200
电渗率(-mr)
0.03
硫酸盐含量 (%)
≤0.1
DNase、RNase、Protease 含量
未检出
三、产品规格
产品名称
货号
AG2000LE-100 g
AG2000LE-500 g
四、运输与保存方法
储存条件
阴凉干燥
运输条件
常温运输
五、使用方法
脉冲场凝胶电泳实验步骤：
1. DNA 样品的制备
为避免大分子DNA在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，本实验使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为例子。
1) 取100 mL对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4 ℃，5000 g离心5 min。
2) 用20 mL TEN缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5 min。之后用 10 mL EC缓冲液使细胞悬浮。
3) 取1.5 mL细胞样品与相同体积含2%低熔点琼脂糖（Cat. No. AG0065LM）的EC缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50 ℃。
4) 对于每一个菌株，需要15～20个凝胶块，将它们放至含有30～45 μg/mL RNase（50 mL的10 mg/mL的RNase）的10 mL EC缓冲液中，于37 ℃振摇过夜。
5) 去掉裂解缓冲液，换为 10 mL ESP缓冲液于50 ℃轻度振摇温育48 h。
6) 将凝胶块放在10 mL含有 174 μg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF）的TE缓冲液中，室温孵育4 h（2 h换液一次），以灭活 ESP 中的蛋白酶 K。
7) 用TE清洗琼脂块6 h（2 h 换液一次），置于TE中4 ℃保存。
2. 限制酶消化
提高PFGE的分辨率取决于100～1000 kb片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。
1) 25 μL 10×反应缓冲液，30 U限制酶，加双蒸水至 250 μL混匀。
2) 取一个凝胶块置其中，合适温度下孵育过夜（按内切酶要求）后，用 TE缓冲液洗涤并贮存。
3. 应用 PFGE 对样品 DNA 进行分析
1) 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8% RadicalTM HGT低电内渗琼脂糖（Cat.No. AG2000LE）凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。
2) 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样品小心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以1:1的比率与50 ℃、2%低熔点琼脂糖（Cat. No. AG0065LM）相混合，迅速注入加样孔中)。
3) 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先 4 ℃冷却。
4) 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速（5～10 mL/min）或打开变速泵至 40。
5) 通过计算机启动极性转换程序。大于50 kb的限制性片段在1.2 s和0.4 s正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5 h或更长。小于50 kb的限制性片段在 0.4 s正向和 0.2 s反向的电脉冲（比率为 2:1）下得以分离，时间为 3～5 h。
6) 在 0.5 μg/ml 溴化乙锭中进行染色并拍照。
4. 分离、纯化大的 DNA片段
1) 凝胶染色、分析后，在目的条带前（靠近正极处）切一个0.25 cm2 左右的槽，注入0.8%低熔点琼脂糖（Cat. No. AG0065LM），使之凝固。
2) 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA的迁移，当目的带进入凝胶槽时，关闭开关，切下目的带，移至1.5 mL EP管中。
3) 加入2 μL的tRNA，30 μL 5 mol/L NaCl，以及370 μL蒸馏水，在65～70 ℃之间，熔化胶并保温 10 min。
4) 苯酚/氯仿500 μL抽提两次。
5) 用2.5倍体积95%乙醇和1/10体积NaAc（3mol/L，pH5.2）于-70 ℃ 10 min沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中。
六、注意事项
1. 本产品仅限科学研究使用，不得用于临床诊断和治疗等领域。
2. 通过微波炉加热溶解琼脂糖时，请始终佩戴护目镜，保护自己和他人免受烫伤。
3. 换缓冲液时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。
4. PMSF是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。
5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。
6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14 ℃，需要一些冷却设备。此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。
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