沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。

 图1. 盐析法沉淀蛋白的过程

盐溶：低盐浓度时，盐离子增强蛋白质溶解度。  

盐析：高盐浓度时，盐离子竞争结合水分子，导致蛋白质脱水聚集沉淀。

分离过程

1.盐选择：常用硫酸铵（溶解度大、温度不敏感、成本低）。  

2.盐浓度调整：  

固体法：逐步加入硫酸铵粉末至目标饱和度。  

饱和溶液法：按比例加入预冷饱和硫酸铵溶液。

3.离心收集：沉淀后低温离心（15,000r/min，20min），弃上清取沉淀。

操作要点

温度：0~4℃操作以减少变性风险。  

pH：接近目标蛋白等电点（pI）时效果最佳。  

蛋白浓度：2.5%~3.0%为宜，过高易共沉淀，过低回收率差。  

梯度优化：通过盐析曲线确定最佳饱和度范围。

二、有机溶剂沉淀法

      通过加入乙醇、丙酮等亲水性有机溶剂，加入后会降低溶液的介电常数，减弱水分子与蛋白质的相互作用，破坏蛋白质表面的水化膜，导致溶解度下降‌；有机溶剂渗透到蛋白质疏水核心区域，破坏维持蛋白质天然构象的疏水相互作用，促使蛋白质聚集沉淀‌；但高浓度有机溶剂可能引起蛋白质部分变性，需严格控制条件（如低温操作）以保持活性‌。

图2.利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图

三、等电点沉淀法分离

原理蛋白质在等电点（pI）时表面净电荷为零，分子间排斥力最小，溶解度最低而沉淀。

分离过程：

1.pH调整：用稀酸/碱调节溶液至目标蛋白pI（如胃蛋白酶pI=1.0，溶菌酶pI=11.0）。  

2.静置沉淀：4℃静置1~2h促进聚集。  

3.离心收集：低温离心（8,000r/min，10min）获得沉淀。

操作要点

精确pH控制：使用pH计精确调节，误差≤0.1。  

金属离子影响：某些金属离子（如Zn²⁺、Ca²⁺）可能改变pI，需注意去除。  

联用策略：常与盐析或有机溶剂法联用提高分辨率。

四、亲和沉淀法分离

原理利用配体（如脱乙酰几丁质）与目标蛋白特异性结合，形成复合物后通过pH或离子强度改变诱导沉淀。

分离过程

1.配体结合：将亲和配体加入样品，特异性结合目标蛋白。  

2.沉淀诱导：调整pH或盐浓度使复合物聚集沉淀。  

3.解离纯化：改变条件（如低pH）释放目标蛋白，离心去除配体。

操作要点

配体选择：需与目标蛋白高亲和且易再生（如His标签蛋白用Ni²⁺柱）。  

温和洗脱：避免剧烈条件导致蛋白失活。  

放大可行性：适用于粗提液直接处理，减少预处理步骤。

五、其他沉淀技术

1. 金属复合盐法

原理：金属离子（Cu²⁺、Zn²⁺）与蛋白质羧基/氨基结合形成不溶复合物。  

操作：添加0.02mol/L金属盐，结合后透析或离子交换去除金属离子。

2. 非离子多聚物沉淀法

原理：PEG通过空间排斥作用促使蛋白质聚集。  

操作：加入4%~20% PEG6000，4℃静置后离心，适用于病毒或抗体纯化。

3. 选择性变性沉淀

原理：利用杂蛋白与目标蛋白对热/酸碱稳定性差异选择性沉淀杂质。  

操作：如60℃加热10min去除不耐热杂蛋白，快速冷却保留目标活性。

六、技术对比与注意事项

‌方法‌	‌分辨率‌	‌活性保留‌	‌适用阶段‌	‌风险‌
盐析法	低	高	粗分离/浓缩	高盐残留需脱盐
有机溶剂沉淀法	高	中（需低温）	精细分离/去盐	易燃、易变性‌
等电点沉淀法	中	高	特定蛋白分离	pH控制严格‌
选择性变性沉淀法	低	低（目标蛋白需稳定）	杂质去除	可能损伤目标蛋白‌

‌操作建议‌：

盐析法优先选用硫酸铵（溶解度梯度大、成本低）‌；有机溶剂需逐滴加入并搅拌，避免局部浓度过高导致不可逆变性‌；等电点沉淀需结合缓冲液pH精确调控（误差≤0.2）。

七、沉淀技术的核心应用

      方向1. ‌初步纯化与浓缩‌通过盐析或有机溶剂沉淀快速降低样品体积，富集目标蛋白（如从发酵液中浓缩酶）‌。‌示例‌：硫酸铵分级沉淀用于抗体粗提，可去除50%以上杂蛋白‌。2. ‌去除非蛋白杂质‌选择性沉淀核酸、多糖等非蛋白成分（如三氯乙酸沉淀核酸）‌。3. ‌与其他技术联用‌‌层析前处理‌：沉淀法浓缩样品，减少后续层析柱载量（如离子交换层析前用盐析去杂）‌。‌透析脱盐‌：盐析后的蛋白质沉淀可直接透析去除残留盐离子‌。

总结

      盐析法：成本低、条件温和，适合大规模粗纯。  

      有机溶剂法：分辨率较高，需严格控制低温防变性。  

      等电点法：常与其他方法联用，优化选择性。  

      亲和法：高特异性，但配体成本较高，适合精细纯化。根据目标蛋白特性、纯度需求及实验条件，可灵活组合上述方法，兼顾效率与产物活性。