一、简介

       琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质、利用核酸分子在电场中时的电荷效应和琼脂凝胶的分子筛效应，达到分离核酸混合物的一种电泳技术。

1、琼脂糖的分子筛效应

1）琼脂糖（Agarose）

       来源于海洋红藻细胞壁，是一种大分子线性聚合物，基本结构是由D-半乳糖和3,6-anhydro-α-L-半乳糖通过β-1,4糖苷键结合而成的双糖单位在α-1,3糖苷键的连接下形成的一个长链。

       琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。常用作电泳、层析等技术中的半固体支持物，用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。

       琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到40℃左右形成良好的半固体状凝胶。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成直径从50nm-200nm不等的孔径结构，孔径的大小由凝胶浓度控制。

       琼脂糖凝胶中孔径的大小，影响了通过的核酸分子的大小以及通过的速度。通常来说，琼脂糖凝胶的浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小，迁移速度也越慢。DNA片段越小，所需的胶浓度越大；而DNA片段越长，所需的胶浓度则越小。选择合适的胶浓度才能更好的分离片段。

2）琼脂的质量评价

       琼脂糖通常通过其凝胶强度和电内渗情况判断质量好坏。强度越高，凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200 g/cm2以上，硫酸根含量在0.2%以下，电内渗在0.13以下。

       琼脂糖是从琼脂中分离而来的。琼脂由琼脂糖和琼脂果胶组成的，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物，和琼脂糖结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，附着到琼脂糖的多糖基质上，造成电内渗（EEO）。电内渗会导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向负极移动，从而造成与DNA反方向迁移的液流，使DNA的分离效果变差。

3）琼脂糖的种类

       琼脂糖主要有标准琼脂糖、低熔点琼脂糖和化学修饰的琼脂糖。标准（高熔点）琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗（EEO），可以灌制浓度低至0.3%的凝胶。低熔点琼脂糖是通过羟乙基化修饰的琼脂糖，羟乙基修饰可降低多糖链间的氢键数目，因此可在较低的温度下熔化，主要用于DNA的快速回收。化学修饰的琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖具有更高的筛分能力。

2、核酸分子的电荷效应

      核酸既含有呈酸性的'磷酸基团'，又含有呈弱碱性的'碱基'，故为'两性电解质'，可发生两性解离。但磷酸的酸性较强，在核酸中除末端磷酸基团外，所有形成'磷酸二酯键'的磷酸基团仍可解离出一个H+，其pK为1.5；而嘌呤和嘧啶碱基为含氮杂环，又有各种取代基，既有碱性解离又有酸性解离的性质，解离情况复杂，但总的来看，它们呈弱碱性。所以，核酸相当于多元酸，具有较强的酸性，当pK>4时，磷酸基团全部解离，呈'多阴离子状态'。

       根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成'阴离子'，置于电场中便向阳极移动，这就是'电泳'。

3、影响电泳迁移速率的一些因素

1）DNA分子量：DNA分子越大，在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢。

2）DNA分子构型：不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如双链环状DNA分子，其中有三种构型：闭环超螺旋分子（cccDNA）、带切口开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

3）胶浓度：对于同种DNA分子，胶浓度越高，电泳速率越慢。

4）电场强度: 电泳电场强度越高,DNA分子迁移速率越快,但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，而且会产生大量的热,使DNA越易降解。所用的电场强度最好处于1~5V/cm范围内,一般在1~2V/cm。

5）荧光染料：染料插入双链DNA造成其负电荷减少，而刚性和强度增加，因此线性DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。

二、特殊琼脂糖凝胶电泳

1）碱性琼脂糊凝胶电泳：在高PH条件下进行，能引起胸腺嘧啶和鸟嘌呤残基丢失一个质子，从而阻止与其配对的各自碱基之间形成氢键，从而使DNA变性。变性DNA保持单链状态，根据其分子大小在碱性琼脂糖凝胶中泳动。

2）RNA变性凝胶电泳：指在配制凝胶时加入甲醛等变性剂用于打开RNA的二级结构，精准的检测RNA的分子量。由于RNA容易形成二级结构，在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法精准确定分子量，只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。甲醛变性凝胶电泳使用MOPS缓冲体系。

3）脉冲场凝胶电泳：大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb)在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

       这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE)。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE)设备能把大小范围在10～2000kb的DNA 片段分开。FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。

三、电泳缓冲液

       缓冲液通常是由「弱酸及其共轭碱」或「弱碱及其共轭酸」缓冲对所组成的溶液，能够在加入一定量其他物质时减缓pH的改变。

1、电泳缓冲液的作用

       在电泳中，通电后阴阳两电极之间形成电场，带电大分子会在电场中向着电性相反的方向运动。阳极发生氧化反应释放电子（An→An+＋e-；An代表阳极材料，如铂、银等金属，），阴极发生还原反应吸收电子（Cathode + nH2O + ne- → H2↑+OH-；Cathode代表阴极材料，如铜、金等金属），此反应造成阴极面形成高碱性边界。

      电泳缓冲液是电泳场中的导体，也是维持电泳系统恒定pH值的必要条件。

       电泳缓冲液的作用主要有:

①维持稳定的pH值。pH值变化可能会使DNA或RNA的结构变化，从而导致迁移速度和聚合物的形态发生改变。

②维护稳定的离子浓度，使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。

③减少离子溶液对DNA的影响。电泳的过程中，DNA是带负电的。如果水溶液中存在电解质，则这些离子可能会接触到DNA，从而破坏DNA分子的结构。例如，电泳缓冲液有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

2、常见的3种缓冲液

       实验中常用的电泳缓冲液主要有三种：TAE、TBE和TPE。

1）TAE缓冲液

      TAE缓冲液是由Tris-乙酸盐和EDTA组成的缓冲液（PH8.0）。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳不可选用。

2）TBE缓冲液

       TBE的是由Tris-硼酸盐与EDTA组成的缓冲液。其特点是缓冲能力强，适合较长时间电泳，分辨率较高，电泳小于1kb的片段时分离效果好。TBE缓冲液中的硼酸成分会影响DNA回收效率以及后续的酶反应，TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。

3）MOPS和TPE缓冲液

      MOPS全名为3-吗啉丙磺酸，是一种酸性化学物质，常温下水溶液的PH值为2.5-4。其化学性质稳定，实用性强，常用于RNA的变性电泳分析。

      TPE由Tris-磷酸盐和EDTA组成的缓冲液，缓冲能力比TAE要高，DNA在其缓冲液中的迁移速度较慢，适用于分离低分子量DNA的电泳实验。缺点是会导致DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。

四、上样缓冲液

       Loading buffer即常用的电泳上样缓冲液，工作浓度是1X 。Loading buffer 主要包含：①十二烷基硫酸钠（SDS）；②甘油；③溴酚蓝；④二甲苯腈蓝FF；⑤EDTA。蛋白上样缓冲液还包含有Tris和还原剂，如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）。

       Loading buffer的作用：①指示作用：溴酚蓝和二甲苯腈蓝可以显示电泳的进程，以便适时终止电泳，同时使样本带有颜色便于简化上样过程。其中，溴酚蓝在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中的迁移率，分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同；二甲苯腈蓝在1%和1.4%琼脂糖中电泳时的迁移速率，分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。

②沉降样品：Loading buffer中的甘油可以增加样品密度，使沉到点样孔中防止样品飘出。③终止酶促反应：SDS主要是促使聚合酶变性，避免其结合在DNA双链上影响迁移速率，同时可以抑制RNase活性，保护RNA；EDTA能螯合金属离子，从而抑制以金属离子做辅基的DNase的活性。

       RNA Loading buffer：一般是DNA Load buffer 经过了DEPC处理或者高温高压灭菌处理后的产品。一些RNA Loading buffer 添加了甲酰胺（一种RNA变性剂和RNA稳定剂），主要用在变性PAGE/Agarose凝胶电泳中。

五、DNA Maker

     通常使用的DNA分子质量标准品源于经限制性内切核酸酶消化的已知序列的质粒或噬菌体DNA，另一种是通过连接已知分子质量的单体DNA片段获得。

六、DNA的凝胶回收

       琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。过酸或过碱等破坏氢键形成的方法都可用于凝胶的再溶化。

       回收方法有：①Tris-HCl饱和酚/氯仿法：加1~3倍TE缓冲液(10mmol/lTris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA)后置65℃水浴使凝胶完全溶解，再用酚氯仿法抽提；②碘化钠/硫代硫酸钠玻璃珠法：用3.5倍体积6mol/L碘化钠溶液熔胶，后用玻璃珠加硫代硫酸钠回收DNA；③离心柱法：通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附DNA。吸附材料有硅基质（高盐低PH结合核酸、低盐高PH洗脱核酸）、阴离子交换树脂（低盐低PH结合核酸、高盐高PH洗脱核酸）等。

      熔胶液常加有指示剂，若电泳缓冲液因陈旧PH偏高，溶胶时可多加点熔胶液或在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC)，为了使DNA分子更好的拦截在膜上，也可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

七、电泳条带分析

1、加样孔有荧光：蛋白质污染，由于蛋白质几乎不会被核酸染料染色，能出现荧光，则一定含有核酸。多数情况下是DNA 与残留的蛋白质结合后，电泳不能出孔而在孔中产生荧光。

2、RNA样本的DNA污染或DNA样本的RNA污染。

3、不规则亮带：在制胶时带入了杂质，形成了障碍物或是制胶时溶胶不完全以致琼脂糖颗粒残留，形成一些浓度较高的区域，在DNA电泳经过这些区域时，部分DNA被阻碍在这里而形成不规则亮带。

4、核酸染料影响：核酸染料都是通过结合到DNA上而通过荧光对DNA进行分析，这就意味采用点染法或胶染法进行核酸检测时，根据使用的染料种类和浓度的不同，核酸染料或多或少会对核酸的迁移率甚至带型产生影响，而且核酸分子量越大影响越大。为得到理想条带，电泳完毕后再进行单独染色对于目的基因判断更准确，DNA也不易产生弯曲、变形、拖尾等现象。

5、凝胶浓度影响：长片段的DNA选用低浓度的凝胶电泳，短片段的DNA则选用高浓度的凝胶电泳。

6、电泳电压影响：通常情况下电压越低，走出的电泳条带越平整。低电压电泳时，电泳缓冲液也不容易发烫，也能确保在电泳的过程中凝胶不会变形。当然电压太低，等待电泳结果的时间就会延长，一般控制电泳电压≤5V/cm，可保证电泳条带的清晰度。

7、电泳时间不足：可以参考溴酚蓝指示带来看条带位置，一般当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。

8、条带太暗或太亮：合适的上样量很重要，上样太少看不到条带，上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较长的DNA此现象更为明显。当然加样量的多少还应依据加样孔的大小及DNA片段的长度而定，加样孔大时上样量应相应加大。

9、核酸染料效果下降：染料过期或保存不当、凝胶在空气中放置过久或电泳缓冲液中泡太久都会导致核酸染料效果下降。

10、显色效果差：凝胶系统拍照时没有选择最适合核酸染料的激发波长或曝光参数选择不当。

11、条带模糊：电泳缓冲液陈旧，电泳缓冲也多次使用后，离子浓度降低，ph值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

12、核酸样品降解：注意防止RNase和DNase污染电泳设备。

13、背景杂乱：核酸样品纯度差，有蛋白污染或盐离子杂质。

14、核酸染料的迁移现象：在琼脂糖凝胶电泳中，核酸分子带负电向正极移动，核酸染料常会带正电荷同时向负极移动，这就会造成电泳图上的一个称作“阴阳面的现象”。而且小分子核酸染料比大分子核酸染料引起的这种现象更明显，因为小分子核酸染料在电泳过程中迁移的更快。

八、核酸染料介绍

       核酸染料是一种能够与核酸结合的化合物，一般是芳香环化合物，分子中含有苯环或吡啶环。这些环结构可以吸收紫外线或蓝光，并发出荧光。核酸染料通常是通过与核酸的碱基中的一种或多种作用来染色。

核酸染料与核酸的结合主要通过电荷作用、氢键作用和疏水作用来完成。核酸通常带负电，而核酸染料一般带正电荷，所以他们通过静电吸引相互结合；核酸染料上的一些基团也可以与核酸碱基之间形成氢键，从而与核酸结合；另外，核酸染料一般不溶于水，疏水性较强的染料与核酸中疏水性较强的碱基也能发生作用。二者结合时，染料的荧光性质会发生改变，这种变化就是我们用来给核酸定量或定性的基础。

1）EB（溴化乙锭）

      溴化乙锭是高度灵敏的嵌入性芳香族荧光化合物，为强致癌诱变剂，但价格便宜，常用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子，并通过范德华力与上下碱基结合，这与DNA的碱基组成无关。

       溴化乙锭的嵌入会使碱基对沿螺旋轴移位，会造成饱和溴化乙锭的DNA分子长度增加10%。溴化乙锭还可与RNA和热变性或单链DNA形成的链间碱基对结合。溴化乙锭在紫外区300nm和518nm处有吸收峰，在紫外光的照射下，溴化乙锭可被激发出橙红色的荧光（605nm）。结合有DNA的溴化乙锭复合物的荧光强度要比没有结合DNA的染料高出20-25倍。

       EB是极易渗透细胞膜与胞内DNA嵌合的小分子，它与DNA嵌合形成稳定的复合物，从而影响DNA的复制，破坏正常的遗传生理现象。EB作为诱变性的化合物，它在人体中诱导突变的机制是不可逆转的。实验者使用时需要谨慎再谨慎，如果只是手接触了EB污染的东西，用肥皂水洗一下就可以解除危险，但若是拿取凝胶这样直接接触EB的动作，切记一定要带手套操作。

2）GoldView I型/II型染料

       GoldView实质上就是吖啶橙（AO），是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm绿色荧光（DNA）、640nm红色荧光（RNA）。

       吖啶橙与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则是由静电吸引堆积在其磷酸根上。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和细胞膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合。

       Goldview对于大片段DNA（＞1kb）的染色效果良好，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好，还有一个很致命的弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。另外Goldview不适用于胶回收，本底色严重，不稳定，在紫外灯下其诱导突变能力极高。Goldview具有细胞渗透性有一定的细胞毒性。建议操作人员使用时一定做好防护措施，带上手套和口罩，并妥善处理好废弃物。

3）GelRed和GelGreen

      美国biotium的GelRed/ GelGreen, 是一种嵌入核酸染料，由两个吖啶橙亚基组成，它们通过线性氧化间隔物桥接。

       相关测试结果表明，该染料的诱变性远小于溴化乙锭（EB），是两种集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。GelRed和GelGreen的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。

       该染料是目前市场中最灵敏的凝胶核酸染料之一，稳定性极好，可以使用微波炉加热，可以在室温下保存。与EB一样，在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解，对DNA和RNA的迁移影响小，小于 SYBR Green I。

       GelRed与EB具有相同的光谱特性，无需改变滤光片及观察装置（普通紫外凝胶透射仪），在300nm处紫外光激发检测即可,在510nm有小激发峰，发射峰600nm。GelGreen具有250 nm至300nm之间的紫外吸收和围绕500nm的强吸收峰，发射峰530nm,并且与254nm紫外透射仪或配备可见光激发的凝胶读取器（例如适用于SYBR Green I的471nm激发的紫外凝胶成像透射仪或可见光凝胶透射仪）兼容。但该染料会使小片段DNA迁移慢一些（与EB相比)。

4）SYBR Green I

      SYBR Green I是一种嵌入型青蓝色染料，在488nm（蓝光）照射激发后，在522nm（绿光）具有发射高峰，同时在284~312nm可见其他激发峰。

       SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小沟里面的，一般用来染双链DNA，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

      SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 适合于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳，和毛细管电泳等。

      SYBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。另外，SYBR Green I与EB相比，诱变能力大大降低。该染料对DNA在凝胶中的迁移影响很大，为得到最好效果，凝胶最好在跑胶后再进行染色。

      SYBR染料-DNA复合物在非极性溶液中可解离，可用乙醇沉淀的方法将SYBR Green I 从DNA中去除。在紫外照射透视下，与双链 DNA 接合的 SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链 DNA 则颜色为橘黄而不是绿色。SYBR Green I能够被玻璃表面强烈吸收，染色溶液应该在塑料容器中配制。

5）SYBR Green II
       SYBR Green II主要用于对电泳后的RNA和单链DNA进行染色。该染料荧光信号强，背景信号低，可检测凝胶中低至100pg的ssDNA或者2ng RNA条带，常用来对多聚甲醛-琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的RNA进行染色。SYBR Green II染料-RNA复合物的荧光不会被尿素或甲醛淬灭，因此在染色之前不必将变性剂洗脱。尽管它不是 RNA 特异的，但SYBR Green II与RNA结合的荧光量子产率（～0.54）高于DNA（～0.36）。
       SYBR Green II最大激发波长在497nm处,次激发波长在245nm附近。发射波长在520nm处产生。SYBR Green II染料检测核酸时既可用于预染也可电泳后染色。
6）SYBR Gold
       SYBR Gold与核酸结合的模式和机制与以往其他常规吡啶嵌入型染料(如溴化乙锭、碘化丙锭)不同，在灵敏度上有明显的优势，是这一系列染料中灵敏度最高的。它一旦结合核酸，荧光会增强1000倍以上。

       SYBRGold染料的最大激发波长为495nm，同时在300nm有第二个激发峰。其荧光发射波长为540nm。

       SYBR Gold可以用于中性聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶中的核酸染色，同时也可以用于含有变性剂(如尿素、乙二醛、甲醛)的凝胶染色。用SYBR Glod染色可以检测出琼脂糖凝胶中小于20pg的双链DNA(是EB染色最低检测量的1/25)。此外，利用SYBR Gold染料进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶染色可以检测出一个条带中含有少至100pg的单链DNA或300pg的RNA。SYBR Gold染料可用于检测包括双链DNA，单链DNA和RNA，适用于琼脂糖凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）研究，以及其他常规的分析。SYBR Gold可很容易地通过乙醇沉淀法从DNA中去除。

7）SYBR Safe
       SYBR Safe是SYBR Green的替代品，在安全性上则更胜一筹。它的诱变性比EB要低得多，但检测灵敏度与EB相当。它的激发峰在280nm和502 nm，发射峰在530nm。因此，核酸被染色后，可通过标准的紫外透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪来查看。大家都知道，紫外光对DNA是有损伤的，如果用SYBR Safe搭配蓝光透射仪，就不会有这种问题，也无需担心紫外线对眼睛的损伤。
8）PicoGreen

       PicoGreen是一种特异性结合dsDNA的饱和荧光染料，激发波长为480nm，发射波长为520nm，与大多数荧光计和荧光酶标仪兼容。

       PicoGreen仅与dsDNA结合后才发出荧光，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。

       PicoGreen产生的荧光强度与dsDNA浓度成正比，且无序列依赖性，非常适合于dsDNA的定量检测。当dsDNA浓度在1.25ng/ml~80ng/ml范围内时线性最好 (R2＞0.99)。

9）Hoechst 33258

       Hoechst 33258是一种细胞渗透性双-苯丙咪唑染料，可高特异性插入双链DNA的小沟，优先与富含A/T区的序列结合，并随A+T含量增加，荧光强度以10的对数增长。

       Hoechst 33258与双链DNA结合产生的的荧光比单链要强3倍左右。Hoechst 33258可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechst-DNA的激发和发射波长分别为350nm和460nm。

10）碘化丙啶（PI）

       碘化丙啶是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。

       它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。