蛋白质(酶)存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化)物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。

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分离纯化的意义

• 从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。

• 工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。

• 医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。

• 基因工程的需要

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蛋白分离纯化的程序

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。

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前处理

分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。

为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。

动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。

组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。

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粗分离

当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。

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细分离

样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。

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结晶

结晶是蛋白质分离纯化的后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。

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蛋白分离纯化的方法

分离纯化某一特定蛋白质的方法一般有沉淀法、层析法、离心法、膜分离、电泳分离。

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沉淀法

1、盐析

实验原理：

中和蛋白质表面电荷并破坏水化膜。

蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH -NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1~100 nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。当大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的 SO42- 和NH4+)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之"失水"，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

影响因素：

• 温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。

• pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。

• 蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

2、等电点沉淀法

实验原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

注意点：不同的蛋白质，具有不同的等电点。同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。

3、有机溶剂沉淀法

实验原理：加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。

有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。

影响因素：

• 有机溶剂的选择 

• 温度的控制

• pH值 

• 离子强度

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层析法

1、离子交换柱层析

实验原理：

以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。是发展最早的层析技术之一，目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段，是基于蛋白质电荷不同的分离技术。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

2、疏水相互作用层析

实验原理：

根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。

蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

优点：

• 与蛋白质作用条件温和。

• 选择性强。

• 具有优良的物理、化学稳定性。

• 无环境污染。

• 易于和其他层析技术联合使用。

蛋白质不适合采用疏水层析的原因一般有两种：

一种是疏水性太强，这样的蛋白质有非常强的疏水相互作用，往往容易导致结合上疏水层析后难以被洗脱下来。需要极其剧烈的洗脱条件，可是剧烈的条件又容易造成蛋白变性。所以不适合采用疏水层析。

另一种就是疏水性太弱，这样的蛋白质亲水性强，疏水性弱，往往加入一点盐后就容易发生盐析作用。难以稳定的存在于高盐的流动相中，也就不适合采用疏水层析。

3、亲和层析

实验原理：

根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合进行分离。它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

优点：

• 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

• 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。

缺点：

• 除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。

• 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。

4、凝胶层析

实验原理：

根据分子大小分离蛋白混合物的最有效的方法之一。混合物随流动相流经装有凝胶固定相的层析柱时，其中各物质因分子大小的的不同而被分离的技术。

优点：

• 凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。

• 分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。

• 分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。

• 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如SephadexG类为102～105d；Sepharose类为105～108d。

缺点：

• 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。

• 层析柱装填困难；

• 对上样量有要求；

• 测定柱效困难；

• 反复使用层析柱困难。

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离心法

1、速率区带离心法

实验原理：

根据分离的粒子在离心力作用下，因其在梯度液中沉降速度的不同，离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内，形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的目的。

注意事项：

由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。容量小，只能用于少量的制备。

2、差速离心法

实验原理：

利用样品中各组分沉降系数的差异，对不同的微粒施以不同的离心力，经过多次离心，离心速度逐步加大，将不同的微粒依次沉降，从而实现离心分离。

区别密度梯度离心和差速离心：

密度梯度离心中单一样品组分的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的;差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离密度梯度离心只用一个离心转速，而差速离心用两个甚至更多的转速。密度梯度离心的物质是密度有一定差异的，而差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分。

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膜分离

1、超滤法

实验原理：

通过加压、抽滤、离心等多种方式，使水和其他小分子溶质透过超滤膜，而蛋白质截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，本质是以静压力差为推动力的膜分离过程。常和离子交换，凝胶过滤联合使用。

优点：

• 血浆蛋白分离采用超滤技术能使得生产工艺设计和设备单简化

• 缩短了生产周期

• 减少污染

• 大大降低生产成本,提高了效益。

2、透析法

实验原理：

利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开，本质是以浓度差为推动力的膜分离过程。常和盐析，盐溶等方法联合使用。

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电泳分离

1、电泳法

实验原理：

各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

影响因素：

主要取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。

电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。常压电泳多用于带电荷的大分子物质的分离，高压电泳多用于带电荷的小分子物质的分离。

溶液的PH：溶液的pH决定了溶液中颗粒分子的解离程度，也就是决定了颗粒分子所带净电荷的多少。对于两性电解质而言，溶液的pH不仅决定颗粒分子所带电荷的种类，而且决定净电荷的数量。溶液的pH离其等电点越远，颗粒所带净电荷越多，泳动速度越快;反之，颗粒的泳动速度则慢。当溶液的pH等于某溶质的等电点时，其净电荷为零，泳动速度也等于零。因此，电泳时溶液的pH应该选择在适当的数值，并需采用缓冲液使pH维持恒定。

溶液离子强度：溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。

电渗：在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。例如，在纸电泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的负电荷，使与滤纸相接触的水在电场中，液体对于固体支持介质的相对移动称为电渗现象。由于电泳支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度;反之，则降低电泳的速度。

支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。