Ni-NTA树脂是一种在分子生物学、生物化学和蛋白质组学中广泛使用的亲和层析介质。它的核心功能是高效、特异地纯化带有组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。

       在使用酵母、哺乳动物细胞表达系统表达含His-tag蛋白时，大多选择分泌表达至培养基上清中，使用Ni-NTA纯化时相对较纯。选择大肠杆菌、昆虫细胞表达系统，可选择分泌或胞内表达。当尤其选择胞内表达时，使用Ni-NTA纯化蛋白，偶尔会出现纯度不佳的情况。或可从以下几个角度尝试改善。

       为什么会纯度不高？

       杂质可能主要来自于：

       非特异性结合：宿主蛋白本身含有组氨酸残基簇，或含有疏水/羧酸残基，与Ni-NTA树脂发生弱结合。

       蛋白降解：目的蛋白被蛋白酶降解，产生含有His标签的碎片。

       蛋白聚集/包涵体：部分变性蛋白与树脂或目的蛋白非特异性结合。

       蛋白间的相互作用：未知与目的蛋白存在作用力相结合，与目的蛋白一同被洗脱。

       核酸结合：带负电的核酸与带正电的Ni²⁺或蛋白结合。

一、 表达前优化

       1. 载体与标签设计：

       组氨酸标签位置：在设计时，建议先查询或预测蛋白N端及C端的结构，选择结构简单的一端，（如果表达的是酶，还需考虑酶的活性中心）加入His标签。将标签放置于简单易暴露的一端，更有利于蛋白的纯化并减少对蛋白活性的影响。

       组氨酸个数：6×His/8×His/10×His，一般分子量越大的蛋白，纯度不佳时（通常更表现为大蛋白挂柱效果不佳，使用低浓度咪唑即可洗脱出大量的目的蛋白），则需要考虑增加组氨酸个数。

       2. 表达条件优化：

       降低蛋白合成速率：降低诱导温度（如从37°C降至16-25°C）；降低诱导剂浓度（如0.01-0.2 mM）或选择温和的诱导剂；降低诱导时间，避免蛋白降解；降低蛋白合成速度，有利于正确折叠。正确的蛋白质折叠更有利于蛋白的纯化。

       3. 蛋白酶缺陷型菌株

二、 细胞破碎与上样准备：创造合适的结合环境

细菌裂解液优化：

       咪唑浓度：在裂解和结合缓冲液中加入低浓度咪唑（如5-20 mM）。通过低浓度咪唑，竞争性洗脱与树脂弱结合的宿主杂蛋白，而不会影响高亲和力的His标签蛋白的结合。

       pH值：确保缓冲液pH在7.5-8.5之间。在此pH范围内，组氨酸的咪唑基团去质子化，能与Ni²⁺有效配位。pH过低会严重影响结合。

       盐浓度：加入高浓度NaCl（如300-500 mM），可以减少蛋白与树脂之间因静电作用造成的非特异性结合（原理同离子交换层析中，氯离子、钠离子的作用）。

       去垢剂：如果蛋白是膜蛋白或易聚集，加入温和的去垢剂（如1% Triton X-100, 0.1-1% CHAPS）有助于溶解并减少非特异性结合。

       蛋白酶抑制剂：添加蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白被降解。

2. 超声条件优化

       超声破碎通过空化效应产生极端的局部压力、温度和剪切力，从而撕裂细胞膜。不恰当的条件会导致以下问题，直接影响纯度：

       宿主蛋白的过度释放：过于剧烈的超声会将大量宿主大肠杆菌自身的蛋白质从细胞碎片中释放出来，与目标重组蛋白混合，增加了后续纯化的负担和难度。

       蛋白降解：物理降解：强烈的剪切力可以直接破坏蛋白质的高级结构，导致目标蛋白变性、聚集或断裂。酶促降解：剧烈破碎会瞬间释放大量胞内蛋白酶，这些蛋白酶与目标蛋白充分接触后降解目标蛋白。

       核酸的释放与粘稠样品的形成：超声会释放基因组DNA，使裂解液变得极其粘稠（加入核酸酶或者多加点裂解液解决），其会非特异性结合带正电的蛋白质或杂质，形成复合物，污染目标蛋白。

       目标蛋白的不可逆沉淀：局部高温和剧烈物理作用可能导致目标蛋白（尤其是疏水性强的或不稳定的蛋白）发生不可逆的变性沉淀，从而降低可溶性蛋白的得率，沉淀物也会污染可溶部分。

       优化策略：对于大多数大肠杆菌样品，建议从20%-40% 的振幅开始尝试，放置于冰水浴中，超声2-5秒，间歇 5-10秒。总超声时间控制在 2~10 min内（达到平台期后，再延长时间破碎率也不会显著提高）。超声的控制对于纯化纯度的影响也十分关键。

3. 澄清裂解液：

       裂解后，需进行高速离心（≥12,000 g，10~30分钟），彻底去除细胞碎片和不溶性蛋白。

       优选的，增加使用0.45 μm或0.22 μm滤膜过滤上清液，除去离心不充分的不溶物质，防止堵塞柱子。

三、 亲和纯化过程

       上样：使用慢流速如0.5-1 mL/min）上样，确保目的蛋白与树脂有充分的时间结合。务必收集上样后的流穿液，通过SDS-PAGE分析，判断结合是否饱和。如果流穿中有大量目的蛋白，说明树脂结合能力已饱和或结合条件不佳。

       洗涤与洗脱：使用含不同浓度咪唑的溶液，20-50mM咪唑吸杂，150-300 mM咪唑洗脱等，或者依靠蛋白纯化仪AB泵实现线性梯度洗脱，找寻最佳浓度。梯度洗脱有助于分离不同亲和力的蛋白（例如，完整蛋白和降解的带His标签的碎片），收集多个小体积的洗脱组分，并通过SDS-PAGE鉴定哪个组分纯度和浓度最高。

四、其它

       咪唑：咪唑因自身纯度的因素，在选择不佳时，对于某些蛋白也会影响纯化时的纯度。（笔者在一次实验中，由于Sigma的咪唑用完，更换使用另一个厂家的咪唑配制相关溶液，纯化蛋白时纯度降低，修正后恢复正常。）

       Ni-NTA：笔者使用及试用过一些厂家的镍柱，使用同一菌体裂解后的上清，经过相同的纯化体系后，在一些蛋白上的纯度上存在明显差异。

       缓冲体系：平衡液/清洗液/洗脱液，笔者会准备两套 磷酸盐及Tris体系的纯化溶液。在过往的经历中，Tris体系对于胞内上清表达的蛋白纯化稍好一些，磷酸盐体系对于包涵体表达的蛋白纯化稍好一些，但也不是绝对。有时更换缓冲体系尝试一下，可能对于纯化会有意想不到的效果。

       如果纯化的蛋白，后续应用不在乎蛋白结构，可选择加入SDS（0.05-0.1%），SDS作为强阴离子去垢剂，通过破坏蛋白质的疏水相互作用和氢键，使蛋白变为线性(原理同SDS-PAGE），His-Tag由于蛋白会更为暴露，且蛋白均变为线性后降低了蛋白之间的相互作用。但这种变性是不可逆的，如果制备的是酶或者需要考虑蛋白的结构，不能考虑这种方法。

       变性纯化：蛋白质的结构易复性，可选择性加入8 M Urea 或 6 M 盐酸胍，以变性包涵体的方式进行纯化，加入变性剂后可降低蛋白之间的相互作用，纯度一般会高。追求高酶活、高稳定性或结构复杂难以复性的蛋白，慎重考虑该方法。

       确定杂蛋白类型：如果有目的蛋白的多克隆抗体，则可通过WB的方式，确认是否为目的蛋白的降解断裂体。（单克隆抗体可能位点识别不对，或识别构象表位，无法鉴定。Anti His-Tag 由于就是使用镍柱纯化获得的，一般均会显色，达不到鉴定的效果）。根据杂蛋白的类型，反推需要改善的点：如果为目的蛋白的降解片段，则考虑超声、蛋白酶等防降解；如果非目的蛋白，则考虑去污剂及纯化体系等。

       关于优化纯化时的纯度实验，没有“一刀切”的方案，需要根据蛋白的特性与纯化的结果进行微调尝试改善。