在发酵液（尤其是使用革兰氏阴性菌，如大肠杆菌的发酵体系）中，内毒素（Endotoxin，即脂多糖LPS）是必须严格控制的杂质，尤其对注射类药物或医疗器械的安全生产至关重要。

一、预防与源头控制

预防与源头控制需要做好宿主选择与发酵工艺优化：

选择低内毒素表达的宿主菌（如某些工程化大肠杆菌菌株）。  

优化发酵条件（如pH、温度、溶氧），减少细胞裂解和LPS释放。  

二、去除方法汇总

1.  阴离子交换层析（AEX）

原理：内毒素带强负电荷（磷酸基团），在高盐或高pH下与阴离子交换树脂（如Q Sepharose）结合。

步骤：调节溶液电导率或pH，使内毒素吸附于树脂，目标产物流穿。

优点：高效且可规模化。

缺点：需优化结合/洗脱条件，避免目标产物损失。

2. 亲和层析（多粘菌素B、组氨酸标签配体）

原理：多粘菌素B（Polymyxin B）特异性结合内毒素的脂质A部分。

步骤：使用多粘菌素B偶联的层析柱吸附内毒素，目标产物通过。

优点：特异性高，适用于终产品精制。

缺点：多粘菌素B可能脱落并引入毒性，需严格验证残留。

3. 疏水相互作用层析（HIC）

原理：利用内毒素的疏水性在高盐条件下与疏水树脂（如苯基琼脂糖）结合。

适用场景：疏水性目标产物（如抗体）与内毒素的分离。

4. 亲和膜

原理：膜表面修饰多粘菌素B或阳离子配体，选择性吸附内毒素。

优点：快速处理，适合连续生产。

缺点：膜成本高，需定期再生。

5. 超滤/切向流过滤（TFF）

原理：通过分子量截留（如10-100 kDa膜）截留大分子内毒素（LPS分子量通常>10 kDa）。  

适用场景：目标产物为小分子（如多肽、小蛋白）时效果显著。  

缺点：对与目标产物分子量相近的内毒素分离效果有限。  

6. 热处理（适用于耐热产物）

原理：高温（如250℃干热或80-100℃湿热）破坏内毒素的脂质A结构，降低其活性。

适用场景：耐高温的器械、玻璃器皿或热稳定性好的溶液（如某些缓冲液）。

缺点：不适用于蛋白质、酶等热敏感产物。

7. 吸附法（如活性炭、硅藻土）

原理：利用吸附剂（活性炭、高岭土、硅藻土）的疏水表面吸附内毒素。

优点：操作简单，成本低。

缺点：可能吸附目标产物，需优化用量和接触时间。

8.离子去垢剂（Triton X-114、脱氧胆酸钠）

原理：通过相分离（Triton X-114在高温下分相）或破坏内毒素胶束结构，促使其聚集。

步骤：加入去垢剂后离心分离两相，内毒素富集在去垢剂相。

适用场景：蛋白质溶液中的内毒素去除。

缺点：去垢剂残留需后续纯化（如透析）。

9. 酸碱处理

原理：极端pH（如pH<2或pH>12）破坏内毒素结构。

步骤：调节溶液pH，保持一定时间后中和。

适用场景：耐酸碱的目标产物（如某些抗生素）。

缺点：可能引起蛋白质变性。

10. 两相萃取（ATPS）

原理：利用聚乙二醇（PEG）/盐或PEG/葡聚糖双水相体系，内毒素分配至PEG相。

步骤：混合后离心分相，回收目标产物所在相。

适用场景：蛋白质与内毒素的分离。

缺点：体系优化复杂，回收率可能较低。

11. 内毒素特异性吸附试剂盒

常用产品：如Pierce™ High-Capacity Endotoxin Removal Resin、ToxEraser®。

原理：预装柱或磁珠结合多粘菌素B或阳离子配体，快速吸附内毒素。

适用场景：实验室小规模或高附加值产物的终纯化。

缺点：成本较高，难以大规模应用。

12. 凝胶过滤法

根据分子大小不同进行分离。内毒素的分子较大，通过选择合适孔径的凝胶过滤介质，可将内毒素与发酵液中的其他小分子物质分离。

该方法条件温和，但处理量相对较小，且凝胶柱需要定期清洗和再生。

13. 组合方法

（1）深层过滤结合层析

先通过深层滤器（如0.2 μm滤膜）去除细胞碎片，再结合离子交换或多粘菌素B层析。  

（2）超滤+亲和层析联用

超滤去除大分子杂质后，使用多粘菌素B柱特异性去内毒素。  

三、注意事项

1. 内毒素的高稳定性

LPS耐高温、耐酸碱，需结合多种方法彻底去除。  

2. 检测与验证

使用鲎试剂（LAL试验）检测内毒素水平（EU/mL）。  

遵循药典标准（如中国药典规定注射用水内毒素限值≤0.25 EU/mL）。  

3. 避免二次污染

纯化设备、层析柱和缓冲液需确保无内毒素残留。  

4. 法规合规性

生物制品需符合FDA、EMA等机构的内毒素限值要求。