在提取、纯化蛋白质时，其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。在提取蛋白质的同时破碎的细胞可释放出蛋白酶，这些酶在与欲提取的蛋白质接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质分解，使实验失败。因此，在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质水解。

（一）常用抑制剂

以下列举了7种常用的蛋白酶抑制剂和它们各自的特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性不同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀，以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

1.苯甲基磺酰氟化物（PMSF）

①抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶），不抑制金属蛋白酶及大部分半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶；

②溶于异丙醇、乙醇、甲醇、1，2-丙二醇。在水溶液中不稳定，在100%异丙醇内，25℃稳定；

③在室温下可保存一年；

④工作浓度：0.1～1.0mmol/L；

⑤在水溶液中不稳定，必须在每一次分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

2.乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）

①抑制金属蛋白水解酶；

②溶于pH8～9的水中，溶液浓度约0.5mol/L；

③溶液在4℃下可稳定6个月以上；

④工作浓度：0.2～1.5mmol/L；

⑤需加入NaOH调节溶液的pH，否则EDTA不溶解。

3.胃蛋白酶抑制剂

①抑制酸性蛋白酶（如胃蛋白酶）、血管紧张肽原酶、组织蛋白酶L和凝乳酶；

②1mg/mL溶于甲醇中，不溶解于水；

③储存液在4℃下一周内稳定，-20℃下可稳定6个月；

④工作浓度：0.7～1μmol/L。

4.亮抑蛋白酶肽

①抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶、血浆酶和组织蛋白酶B；

②10mg/mL溶于水；

③储存液4℃下稳定一周，-20℃下可稳定6个月；

④工作浓度：0.5mg/mL。

5.胰蛋白酶抑制剂

①抑制丝氨酸蛋白酶（如血浆酶）、血管舒缓素、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；

②10mg/mL溶于水，pH7～8，在pH＞12.8时失活；

③储存液4℃下稳定一周，-20℃下可稳定6个月，避免反复冻融；

④工作浓度：0.01～0.3μmol/L。

6.抑胃肽

①抑制天冬氨酸蛋白酶（如胃蛋白酶）、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶和很多微生物的酸性蛋白酶；

②溶于甲醇，约1mg/mL，也可溶于乙醇或6mol/L乙酸（约300μg/mL），不溶于水，4℃下至少一周内稳定；

③工作浓度：0.7μg/mL。

7.胱蛋白酶抑制剂

①抑制半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶B和二肽酰肽酶；

②将500μg胱蛋白酶抑制剂溶解于含20%甘油的重蒸水中，-20℃冷冻，两个月内稳定；

③工作浓度：250μg/mL。

（二）蛋白酶抑制剂的混合使用

在科研实践中，也经常需要蛋白酶抑制剂混合使用。蛋白酶抑制剂混合使用是为了能同时抑制多种不同的蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等，而且可应用于几乎所有的组织或细胞提取物，包括来自动物、植物、酵母菌、细菌和真菌的样品。

以下是一个蛋白酶抑制剂混合使用的实例：

将35μg/mL PMSF 35μg、0.3mg/mL EDTA 0.3mg、0.7μg/mL胃蛋白酶抑制剂0.7μg和0.5μg/mL亮抑蛋白酶肽0.5μg定溶于1mL溶液中，即得到一种蛋白酶混合抑制剂。