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抗体纯化琼脂糖磁珠
(Magarose-ProA、ProG、ProA/G、ProL)
一、概述
Magarose-ProA(ProG、ProA/G、ProL)系列产品是磁性琼脂糖微球与Protein A(or Protein G\AG\L)共价结合形成。与市场上同类免疫磁珠产品相比,该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率,洗脱条件更均一,一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。本品为微米级磁性微球,可在15 min内完成抗体吸附过程,30 min内完成抗体纯化流程。本产品可重复使用,适用于血浆、腹水、组织培养上清液等样品中的抗体纯化,也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择磁珠的类别,Magarose-ProA(ProG、ProA/G、ProL)磁珠与不同抗体的亲和性比较参见:http://www.purimagbead.com/html/4309815423.html。
二、产品特性
产品名称
Magarose-ProA (ProG、ProA/G、ProL)
货号
PMAG008-1 (-2、-3、-4)
磁珠浓度
25% (v/v) in PBST(含0.05% NaN3)
配基密度
/
介质
6%交联磁性琼脂糖
粒径
20-45μm
配体结合
3~20 mg Human IgG /ml磁珠
保存
常温运输,2~8℃保存一年
注:磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性相关,此处仅作参考值。
三、使用方法
(一). 缓冲液
Binding/Washing buffer PBST(pH 7.2~7.4): 137 mM NaCl,2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2.0 mM KH2PO4, 0.1% Tween-20;
NP40 Cell Lysis Buffer: 150mM NaCl, 1% NP40, 50mM Tris, pH 7.4
Elution buffer: 100mM Glycine, 0.1% Tween-20, pH 2.5;
Neutrilization buffer: 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0;
(二). 操作流程
1) 样品处理
血清样品处理:若目标蛋白丰度较高,建议用 Binding Buffer 稀释样品至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL,置于冰上备用(或-20℃长期保存)。
悬浮细胞样品处理:离心收集细胞(4℃, 500 g, 10 min),弃上清后称重,按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加PBS洗涤2次;按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加NP40 Cell Lysis Buffer,同时加蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF),混匀后于冰上处理 10min;离心收集上清(4℃,14000 g,10 min),置于冰上备用(或-20℃长期保存)。
贴壁细胞样品处理:移去培养基,用PBS洗涤两次;用胰酶消化或者细胞刮刀,收集1.5 mL离心管内,按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加PBS洗涤2次;按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加NP40 Cell Lysis Buffer,同时加蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF),混匀后于冰上处理10min;离心收集上清(4℃, 14000 g, 10 min),置于冰上备用(或-20℃长期保存)。
大肠杆菌样品处理:离心收集大肠杆菌(4℃, 12000 g, 2 min),弃上清后称重,按每克(湿重)菌体10 mL的比例用PBS洗涤2次;按每克(湿重)菌体5~10 mL 的比例加入Binding Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF),重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃, 17000 g, 10 min)。
2) 磁珠预处理:将抗体纯化磁珠漩涡振荡30 s,使磁珠充分重悬;取40 μL 25 %(v/v)磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。磁分离,弃上清,用1 mL Binding/Washing buffer洗2次,磁分离,管中磁珠可直接用于抗体分离。
注:该步骤磁珠的用量可根据磁珠对目标抗体的最大结合量进行调节。
3) 抗体吸附:
A. 用 100µLPBST 稀释 2~20µg 抗体样品,稀释后加入磁珠离心管; 注:实际抗体使用量需根据实验摸索,可参看磁珠对应不同抗体亚型的亲和力表;
B. 将上述混合物放入旋转混匀仪室温混匀10~15分钟;
C. 磁分离,去上清;用 100µLPBST 洗磁珠3 次。
4)抗原沉淀反应
A. 抗原吸附:向上一步装有磁珠-抗体复合物的离心管加入细胞裂解液100~1000µL,移液枪吹打混匀;
B. 37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀 15~20 分钟,使抗原和结合抗体的磁珠结合;
注:为使结合充分,孵育时间温度可据实际需求调整;
C. 将上一步的离心管和混合物放入磁力架,吸取上清(上清可丢弃也可保存做后续分析);
D. 取 200µL PBS 洗涤磁珠-抗体-抗原复合物 3 次;
E. 洗涤后用 100µL PBS 重悬磁珠,用于下一步操作。
注:抗原洗脱前将磁珠转移新的离心管,避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱。
5)抗原洗脱
操作者根据后期检测需要选择抗原洗脱方法。
变性洗脱法: 将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管放入磁力架,磁分离去上清;向离心管中加入25µLElution Buffer和5µL 5x SDS-PAGE Loading Buffer(自备)再用移液器重悬复合物; 95~100℃煮沸5~10分钟;将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析(注:上清液中含有抗原勿丢弃)。
非变性洗脱法: 将沉淀抗原第5步骤中的磁珠放入磁力架,磁分离去上清;向离心管中加入约30µL的Elution Buffer,用移液器轻轻混匀避免气泡产生,颠倒混匀或者低速涡旋混匀2~5分钟;将磁珠放入磁力架,磁性分离收集上清(注:上清液中含有抗原勿丢弃); 中和:上述步骤收集上清中抗原,若需做功能验证需加入Neutralization Buffer(例:100µLElution Buffer加入10 µL Neutralization Buffer即可)。
6)Target Antigen Detection(沉淀后抗原分析)
A. 变性洗脱抗原适用方向
1. 蛋白染色鉴定; 2. Western blotting;3. SDS-PAGE for Fluorography
B. 非变性洗脱抗原适用方向
1. 蛋白特征分析;2. 免疫;3. 酶学研究;4. 氨基酸序列分析;5. 蛋白晶体结构分析
C. 未做洗脱抗原适用方向
1. 蛋白相互作用;2. 酶学研究;3. 生物分析;4. 免疫学分析
(三). 磁珠再生
1. 磁珠多次使用后会有沉淀蛋白、强疏水性蛋白、脂蛋白等杂质非特异性吸附到磁珠上,为了保证磁珠的使用效率,建议持续使用 5 次后进行磁珠再生处理。
2. 按约每 1 mL 10%(v/v) 磁珠加入 1 mL 1%(v/v)Triron X-100 磁珠再生缓冲液,振荡均匀,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转混合,10 min 后进行磁性分离,弃上清液。
3. 立即加入 1 mL Binding/Washing buffer 进行重悬,然后磁性分离,弃上清液,重复该操作 3 次。
4. 加入1 mL Storage buffer重悬磁珠,置于2~8℃保存。
(四). 注意事项
1. 磁珠应保存在储存溶液中,防止干燥;
2. 请勿将磁珠冷冻或离心,以免引起不可逆聚集;
3. 为保证最佳的实验结果,请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应;
4. 操作者可根据实际需求,利用抗体结合反应步骤以及抗原结合反应步骤中收集的上清液检测抗体、抗原和磁珠的结合情况;
5. 对于 IP 实验,不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,抗体与抗原结合还会受到结合缓冲液和洗涤缓冲液的影响,因此,如果操作者使用本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果,可自行筛选及配制缓冲液进行实验;
6. 本磁珠表面包被的重组蛋白 Protein A/G 在极端条件下(如低 pH、加热处理)存在极低的蛋白脱落情况;
7. 不建议操作者用于分子量约 130 kD 目标蛋白的免疫沉淀实验;
8. 本产品仅供研究使用。