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His-tag蛋白纯化用琼脂糖磁珠
（Magarose-IDA/NTA/TED）
一、概述
His-Tag 蛋白纯化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）针对纯化 His 标签蛋白而研制的一种新型纯化介质，具有高效、快速、方便等特点，可通过磁分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，极大地简化纯化工艺和提高纯化效率，适合科研和工业领域便捷地进行 His-tag 蛋白的纯化。
二、产品特性
产品名称
Magarose-IDA/NTA/TED
货号
PMAG001-1/001-2/001-3
磁珠浓度
25%（v/v）in 20% 乙醇
配基
IDA or NTA or TED
介质
6%交联磁性琼脂糖
粒径
20-45μm
配体结合
~20mg融合蛋白(27KD)/ml IDA磁珠
~20mg融合蛋白(27KD)/ml NTA磁珠
~2mg融合蛋白(27KD)/ml TED磁珠
保存
常温运输，2~8℃保存一年
注：IDA结合容量高，耐螯合剂差；NTA结合容量较高，耐螯合剂较好；TED结合容量低，耐螯合剂优异。
三、使用方法
1. 推荐的缓冲液
A. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
Binding Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 5~20mM咪唑, pH7.4;
Wash Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 20~100mM咪唑, pH7.4;
Elution Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 300-500mM咪唑, pH7.4;
B. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
Binding Buffer: 8M Urea, 50mM NaH2PO4, 100mM Tris·HCl, pH8.0;
Wash Buffer: 8M Urea, 50 mM NaH2PO4, 100 mM Tris·HCl, pH6.3;
Elution Buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH2PO4, 100mM Tris·HCl, 300-500 mM 咪唑, pH4.5;
Note: Buffer 在使用前需用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。推荐的 Buffer 体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，在 Binding Buffer 中添加一定浓度的咪唑可降低非特异性结合，提高目的蛋白的纯度。初次使用的客户可以采用推荐的缓冲液，再根据实验结果适当调整缓冲液中的咪唑浓度。
2. 样品准备
2.1组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌下非变性条件下可溶性表达）
稀释重组表达的蛋白：每克大肠杆菌菌体加入5~10 ml binding buffer重悬。样品和binding buffer含同样浓度的咪唑可避免宿主细胞表达的含组氨酸的蛋白。同时要去除大颗粒和高浓度的螯合剂，如EDTA，组氨酸、柠檬酸等杂质，防止破坏Ni-NTA树脂。
1. 酶解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNase，1 mM MgCl2，1 mM PMSF（终浓度）或其他蛋白酶抑制剂。加入的抑制剂必须对磁珠无影响，4°C混匀30分钟。
2. 机械裂解：超声，均质，反复冻融等。
3. 调整裂解液的pH到7.4：不要用强碱或酸调节pH（防止沉淀）。
4. 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4°C 12000 rpm离心20 min，温度的选择取决于蛋白稳定性。
5. 收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。
6. 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸铵进行蛋白沉淀。用1X PBS透析，加入到磁珠中，如果样品中不含EDTA，组氨酸，柠檬酸等影响磁珠的成分，可直接上柱。
2.2组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌中包涵体表达变性条件纯化）
1. 用1×PBS悬浮细胞（每ml细菌沉淀约5 ml 1× PBS），按照上面的超声条件进行实验。
2. 裂解液在12,000 rpm离心10 min收集包涵体。用1×PBS洗涤几次包涵体。
3. 用Binding/Wash buffer溶解包涵体（每ml包涵体约5 ml Buffer），并在室温下孵育30~60 min。可能需要均质或超声将沉淀完全溶解。
4. 12,000 rpm离心30 min去除剩余的不溶物。小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀。
2.3组氨酸标签蛋白纯化步骤
磁珠的使用量由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得，这里以获得 5-10mg目标蛋白为例：
1. 磁珠准备：将Ni-NTA磁珠充分混匀，使用移液器取2 ml 的磁珠悬浮液，（磁珠沉降体积500μl）置于离心管中，磁分离，待溶液澄清，吸弃清液，加入ddH2O反复清洗，去除酒精。
2. 磁珠平衡：加入5 ml Binding Buffer，反复吹打5-10次，磁分离，待溶液澄清，吸弃清液，重复洗2次。
3. 磁珠与目的蛋白结合：用10 ml Binding Buffer悬浮2 g湿重菌体，进行破损和裂解后，即为目的蛋白粗样，将粗蛋白破碎液加入磁珠，颠倒混匀。室温孵育15 min（如目标蛋白不稳定，置于2-8°C下孵育30 min）。
4. 洗杂：置离心管于磁分离器，待溶液澄清，移出上清液，保留以备取样检测。向离心管中加入10 ml Wash Buffer，反复吹打5-10次，磁分离，待溶液澄清，吸取上清液，保留以备检测。重复洗杂步骤3次以上。
5. 洗脱：用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2-10 ml Elution Buffer 加入到离心管中，重悬磁珠混匀，磁分离，待溶液澄清，吸取上清液，即为目的蛋白组分。重复上述步骤多次，分别收集洗脱组分并留样检测，以提高目的蛋白的回收量。
6. 磁珠后处理：加入5 ml Elution Buffer，重悬磁珠，磁分离，吸弃上清，重复该步骤2次。再用5 ml ddH2O反复清洗3-5次。最后，加入2 ml 20%的乙醇溶液，使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积，保存于2-8°C。
7. SDS-PAGE检测：纯化所得样品用SDS-PAGE 检测。
8. 磁珠再生：磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。
Stripping Buffer: 20 mM Sodium Phosphate, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7.4
Washing Buffer（可选）: 0.5 M NaOH, 2 M NaCl
Recharge Buffer: 100 mM NiSO4（该化学试剂有一定的毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意）以5 mL 10%（v/v）磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：
1) 将磁珠悬液磁分离，去除上清，在离心管中加入5 mL ddH2O，重悬磁珠，磁分离去除上清液。
2) 加入5 mL Stripping Buffer，重悬磁珠，室温混旋5 min，磁分离，去除上清液。重复此步骤1次。
3) 加入5 mL ddH2O，重悬磁珠，磁分离去除上清液，重复此步骤 2次。
4) 碱处理：加入5 mL Washing Buffer，重悬磁珠，室温旋转混合5 min，磁分离，去除上清液。加入5 mL ddH2O，重悬磁珠，磁分离，去除上清液。重复 ddH2O洗涤步骤3~5次，至洗涤液呈中性。
5) 加入5 mL Recharge Buffer，重悬磁珠，室温旋转混合20 min，磁性离，去除上清液。
6) 加入5 mL ddH2O，重悬磁珠，磁性离，去除上清液。重复此步骤4次以上，保证镍离子去除完全。
7) 加入2ml 20%的乙醇溶液，使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积，保存于2-8°C。
3．注意事项
1) 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；
2) 使用产品前务必充分振荡使磁珠均匀悬浮；
3) 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；
4) 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；
5) 本产品重复使用时建议纯化同种蛋白，纯化不同蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；
6) 本产品需与磁性分离器配套使用；
